前叉之家
作者：河北医科大学第三医院关节二科 王弘德
前交叉韧带损伤是运动医学领域最常见的损伤。前交叉韧带受伤因素复杂，加之韧带位于关节腔内被滑膜包裹血供差，自愈能力也较差。前交叉韧带重建术作为当前治疗前交叉韧带损伤的金标准，但是重建后韧带的力学适应能力未能达到原有韧带水平，自体韧带存在供区并发症风险，异体韧带存在腱骨愈合缓慢、疾病传播及排异反应的风险，这些风险促使众多外科医生寻求新的治疗方法。使用残端保留技术重建前交叉韧带术后获得令人满意的效果，这不仅与残端的周围滑膜组织和内部生长因子为韧带修复提供良好的微环境有关，更重要的是这揭示了前交叉韧带中可能存在具有自我更新和多项分化潜能的细胞。Fu等从人的前交叉韧带中成功分离出具有自我更新和多项分化潜能的间充质干细胞，这一发现为前交叉韧带再生和修复提供了合适的种子细胞，有望成为前交叉韧带损伤治疗的新方法。本文将围绕前交叉韧带损伤原因、治疗方法、干细胞治疗、干细胞对腱骨愈合影响及干细胞治疗存在问题的相关研究进展进行综述，并探讨干细胞在前交叉韧带损伤治疗中的应用前景。
前交叉韧带损伤原因
前交叉韧带损伤多见于运动损伤，其中打篮球、踢足球和滑雪运动是引起前交叉韧带断裂最常见病因。前交叉韧带损伤的高发病率源于诸多危险因素存在。①环境因素：场地摩擦力大、气候炎热等因素增加了损伤风险。②解剖学因素：有研究报道女性足球运动员前交叉韧带断裂的风险是男运动员的3倍。③内分泌因素：女性月经周期ACL损伤风险明显增加，这与雌激素水平较高有关。④神经肌肉因素：肌肉激活方式的改变、肌肉刚性不足，增加了ACL损伤的风险。
前交叉韧带损伤治疗方法
过去采用缝合前交叉韧带的治疗方法，术后超过90%的患者仍存在持续的膝关节不稳。因此手术重建治疗是目前推荐的治疗方法，尤其对于从事膝关节高负荷日常活动以及有急停-加速运动的运动员。目前手术治疗的金标准是常采用自体肌腱（如半腱肌、股薄肌）或髌腱用于前交叉韧带重建。支具固定、本体感觉训练和肌力练习等非手术治疗也可增加膝关节稳定性。Costa-Paz等使用MRI分别对14例前交叉韧带损伤延期手术治疗的患者进行随访，发现所有患者均发生断端对断端愈合，并测试轴移试验阴性，这说明前交叉韧带存在自发愈合的能力。后来在未成年运动员的前交叉韧带股骨止点附近使用微骨折技术，使其产生血凝块促进前交叉韧带在原位黏附，恢复了膝关节稳定性和功能，这一技术称之为愈合反应技术（HRT）。但是Wasmaier等在对使用HRT方法治疗的研究中发现，36%HRT组患者最终仍需进行前交叉韧带重建，并未获得理想的治疗效果。
随着当前新技术应用于前交叉韧带损伤治疗中，治疗的成功率得到极大提高，但是在能够加快韧带愈合和重塑、减少韧带松弛、提高韧带血管化的新工具和方法仍然是研究热点。组织工程学的发展使得组织工程韧带修复和重建前交叉韧带成为可能。完备的组织工程需具备组织特殊分化细胞、结构支架、生物调节因子、机械调节因子。其关键因素在于具有自我更新和多项分化潜能的干细胞，分布于结构支架，在生物和机械因子调解下逐渐；增殖分化，最终塑形替代结构支架。
干细胞
干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞群，根据分化潜能髁分为3类：①全能干细胞：具有分化为完整个体潜能，只有胚胎属于全能干细胞。②多能干细胞：具有分化为多种组织细胞潜能，但不能分化为完整个体，如骨髓造血干细胞、骨髓间充质干细胞。③专能干细胞：只能向一种类型或密切相关的两种类型细胞分化，如上皮组织基底层干细胞。随着干细胞生物学的飞速发展，干细胞治疗已在许多领域得到应用，干细胞在运动学领域治疗前交叉韧带损伤的研究也取得初步成果，目前对间充质干细胞及近年来新发现的肌腱/韧带干细胞的研究为干细胞治疗前交叉韧带损伤展示了广阔的前景。
间充质干细胞间充质干细胞是来源于中胚层的一种具有高度分化潜能的成体干细胞，存在于全身器官间质和结缔组织中，在特定条件下可分化为多种中胚层来源细胞，最早是从骨髓中分离而来，随后逐渐从肌肉、肌腱、韧带、脐带、滑膜、脂肪细胞等组织中提取出来。国际细胞治疗协会定义了间充质干细胞鉴定标准：①在标准培养状态下必须具有塑料粘附性；②必须表达CD73、CD90和CD105基因，不表达CD11b、CD14、CD19或CD79α、CD34、CD45基因和HLADR表面分子；③必须具有分化为骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的潜能。由于在人体内治疗使用胚胎干细胞的研究一直存在伦理问题的争论，间充质干细胞的应用避免了上述问题的发生，加之间充质干细胞来源广、取材容易，因此间充质干细胞成为当前研究最多和首先被分离并投入使用的干细胞。
在许多动物实验中间充质干细胞已经通过关节腔内注射用于研究其再生的潜能。在应用于临床之前，最大的挑战来自于注射后干细胞的结局。Agung等将从绿色荧光蛋白转基因鼠体内提取的间充质干细胞，注射到具有前交叉韧带损伤、内侧半月板损伤和股骨髁软骨损伤的鼠关节腔内，4周后发现不仅在损伤部位出现了绿色荧光蛋白阳性的细胞，而且阳性细胞外间质也可被甲苯胺蓝染成蓝色，这说明间充质干细胞通过关节前内注射参与了前交叉韧带组织再生。Kanaya等证实在前交叉韧带部分断裂的鼠关节腔内注射间充质干细胞，1周后胶原纤维含量明显高于对照组，2周后Sharpey纤维含量明显高于对照组，4周后腱骨界面消失，有效提高组织学评分和生物力学性质。Ju等使用小鼠跟腱重建前交叉韧带，在隧道内注射间充质干细胞，1周后腱骨界面出现大量标记的间充质干细胞，且胶原纤维比例明显高于对照组，2周后隧道内成纤维细胞含量明显高于对照组，这说明间充质干细胞能促进腱-骨早期愈合。但是Becerra等使用TC99m对间充质干细胞标记，分别通过静脉注射和损伤韧带局部注射，静脉注射组未在损伤区域发现标记细胞，局部注射组在24h后也仅有24%剩余标记细胞，说明细胞损失量较大，更有效的应用方法仍需进一步研究。
Lim等在使用包被有骨髓间充质干细胞的自体韧带重建兔前交叉韧带的试验中发现，处理组韧带在腱-骨连接处结构更接近正常前交叉韧带附着点，提高了韧带的失败负荷和刚度。最新一项研究表明，使用负载有间充质干细胞负载的手术缝线修复大鼠跟腱比采用普通缝线或普通缝线加伤处注射间充质干细胞效果更明显，其所修复组织的力学强度及组织学评分更佳。干细胞能否成为损伤区域组织并发挥功能也尚无定论。间充质干细胞能产生MMPs（包括MMPs-2、-3、-10、-11、13）和TIMP-2，MMP/TIMP平衡关系在将机械信号转变为间充质干细胞功能方面至关重要。
Silva等在对前交叉韧带重建移植物-骨愈合的研究中，对20例患者在前交叉韧带重建术中使用被未经培养的成人骨髓间充质干细胞（BMSCs）处理过的移植物，术后MRI评价在处理组和对照组间无差异，术中取股骨隧道活组织进行组织学检查，发现二者在细胞和胶原含量和血管化无差异，因此Silva等认为未经培养的骨髓间充质干细胞不能促进前交叉韧带重建术后移植物-骨愈合。
肌腱/韧带干细胞（TSCs/LSCs）发现和生物学特性：Salingcarnboriboon等首次从鼠肌腱中分出同间充质干细胞相似的具有多项分化潜能的细胞群。后来在人类前交叉韧带中也分离出的干细胞，与骨髓间充质干细胞相比具有更快的增殖速率。肌腱干细胞具有许多和其他干细胞相同的细胞表面标记物，如Sca-1，CD44，CD90，CD90.1，CD90.2，CD105，Stro-1，CD146，nuclestemin，Oct-4，和SSEA-4。有研究发现，年幼和年老的大鼠的肌腱干细胞共同表达nuclestemin，Oct-4，和SSEA-4，年幼的大鼠CD90.1表达水平较高，而年长的大鼠CD44表达水平较高。肌腱细胞属于特异性成熟细胞，已不具备分化为其他类型细胞的能力，也不能像肌腱干细胞一样表达干细胞基因，如：nuclestemin，Oct-4，和SSEA-4。虽然肌腱干细胞有许多细胞表型，但是其特异性表型仍未发现。
肌腱干细胞具有比终末细胞更快的增值能力，年幼肌腱干细胞比年老增殖能力更强。肌腱干细胞具有多向分化潜能，不仅可以分化成肌腱细胞，在一定条件下还能转变为非肌腱细胞，如脂肪细胞，软骨细胞和骨细胞。肌腱干细胞的增殖和分化能力受多因素调节，如：氧分压、机械力学负荷、生物因子、间质细胞和细胞外基质。纳米纤维支架为人肌腱干细胞提供有益的微环境，可以诱导肌腱干细胞向腱性组织分化，不规则排列的纳米纤维支架则促进肌腱干细胞成骨分化，因此使用适当的支架不仅可以维持肌腱干细胞的性质，而且可以促进向腱性组织分化有利于肌腱损伤的修复。
目前肌腱、韧带干细胞主要应用于腱-骨界面再生的研究中，Lui等使用组织连接因子、抗坏血酸促使绿色荧光蛋白转基因鼠肌腱干细胞形成细胞层，将该细胞层包裹在肌腱移植物表面用于鼠前交叉韧带重建，与对照组相比增加了在骨隧道内骨密度和骨量，明显改善其力学性质。Mastsumoto等将狗自体前交叉韧带切除后缝至胫骨侧移植物表面，处理组胫骨隧道缩小且最终失败负荷是对照组的两倍。Mifune等发现，在老鼠前交叉韧带术后关节内注射内使用来自自体前交叉韧带提取的CD34+细胞后有利于血管化和骨化促进韧带愈合，提高生物力学性质。在另一项研究中，Mifune等在鼠体内使用来自自体前交叉CD34+细胞层包裹的移植物重建前交叉韧带，增加前交叉韧带术后本体感觉的恢复，促进韧带成熟，促进骨-腱愈合，改善了生物力学性质。
间充质干细胞与肌腱／韧带干细胞的比较
虽然来自不同组织的干细胞具有许多共同的生物学特性，如塑料粘附性、集落生成、多系分化潜能，但是其增殖和分化能力存在差异。肌腱干细胞与其它干细胞相比保留了更多的组织特异性分化潜能，这使其在肌腱韧带修复组织工程学方面与间充质干细胞相比更具优势。鼠的肌腱干细胞中Scx，Comp，Sox9和Runx2的mRNA水平高于骨髓间充质干细胞，人肌腱干细胞中腱调蛋白（TNMD）表达高于骨髓间充质干细胞。肌腱干细胞与骨髓间充质干细胞相比具有更强的成骨和成腱诱导能力，这为腱－骨愈合提供了更有力的基础。鼠和人肌腱干细胞Ca2+积累速度是骨髓间充质干细胞的4倍。此外，肌腱干细胞在集落能力和增殖能力方面也优于骨髓间充质干细胞。鼠和人类同一个体的肌腱干细胞增殖速度明显高于骨髓间充质干细胞。
干细胞促进腱－骨愈合
正常腱－骨连接界面具有纤维结缔组织、非钙化的纤维结缔组织、钙化的纤维软骨、骨组织的四层组织结构形成了从软组织向骨组织转化的过渡，有利于传递、缓冲应力，肌腱修复，胶原重塑。前交叉韧带损伤后，虽然通过前交叉韧带重建的外科手术方式可以很大程度的恢复腱－骨连接之间的力学特性，然而腱－骨连接界面的复杂组织学结构却难以恢复，加之重建手术技术差异，术后再次损伤的情况仍无法避免。
因此，腱－骨连接界面的修复重建核心在于恢复肌腱组织与骨组织之间的组织学结构。在鼠跟腱止点重建模型中注射骨髓间充质干细胞，术后45d在腱－骨界面形成类似正常界面的四层组织学结构。但是，在鼠肩袖止点修复重建模型中发现，单独的间充质干细胞在修复界面环境下不能向着目的分化方向分化，需其它生物因子来诱导干细胞向目的方向分化。之后Gulotta等将筛选出的MT1-MMP和Scx两个腱骨形成相关基因转染骨髓间充质干细胞发现，MT1-MMP组在第4周较正常间充质干细胞组具有更高生物力学强度，Scx组在第4周较正常间充质干细胞形成更多纤维软骨。因此肌腱干细胞促进腱骨愈合能力比骨髓间充质干细胞更具优势：首先，肌腱干细胞源于肌腱，这使其更易适应腱骨界面为环境，向目的方向分化；其次，肌腱干细胞比骨髓间充质干细胞增殖能力更强，加快腱骨界面愈合；此外，肌腱干细胞表面具有更多的成软骨和成骨标志物，经诱导后成软骨和成骨更有利于腱骨界面纤维软骨区域再生。
干细胞治疗前交叉韧带损伤的潜在问题
安全性一直是使用干细胞治疗的关键，因此在投入临床应用前，肿瘤分化和形成有害的异位组织的潜能仍需谨慎对待。有报道指出，使用骨髓间充质干细胞治疗肌腱损伤存在移位骨化和肿瘤发生的风险。虽然从生物学角度讲，使用自体来源肌腱干细胞是最理想的治疗选择，但是体内肌腱干细胞数量有限，人类腘绳肌腱和小鼠髌腱含3%~4%肌腱干细胞，而大鼠屈肌腱仅含1%~2%的肌腱干细胞。因此肌腱干细胞取材较难，未来应用肌腱干细胞可能需要在手术中取自体肌腱或者韧带或者使用异体来源的肌腱干细胞。此外，尽管提取方法得到不断改进，但是如何提高干细胞纯度仍是不可忽视的问题。如何将提取的肌腱干细胞在培养和扩增过程中保持其干性仍然有待解决。
展望
干细胞在骨科领域及运动医学领域的应用仍处于早期阶段，将其应用于日常临床治疗仍有很长的过程。选择哪一种干细胞类型对韧带组织再生最有效仍无定论。到目前为止，仍然不清楚究竟是源于干细胞的营养因子促进组织再生还是细胞本身形成新的组织。虽然大量研究报道了在不同动物体内应用间充质干细胞和肌腱／韧带干细胞对前交叉韧带损伤的成功应用，但是仍需大量研究进一步证明在人体使用的效果。任何干细胞治疗方法都是复杂和昂贵的，所以相比当前治疗方法，干细胞治疗前交叉韧带损伤在临床应用的高效性和益处仍需论证。
目前对干细胞特性的研究为治疗前交叉韧带损伤提供了可能性，因而如何调节干细胞向韧带组织分化，以及在腱-骨连接处向骨、软骨分化成为治疗前交叉韧带损伤的关键。基于将干细胞应用于前交叉韧带损伤治疗的广泛前景，有望打破传统治疗方法，为今后治疗前交叉韧带损伤需找一种新的方法，并使人们对干细胞的研究更加深入。
来源：中国骨与关节损伤杂志2016年12月第31卷第12期
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